lisa ai换脸 长爪栘[木衣]叶绿体基因组特征系统发育及密码子偏好性分析

叶绿体基因组中包含着诸多与植物光合营用相关的关节基因[1]。凭借其单亲遗传的秉性lisa ai换脸，叶绿体基因组在植物系统发育连络方面阐发着首要作用，是系统发育连络的理念念器具[2-3]。基于Illumnia平台的高通量测序技能的出现，大地面减少了测序的本钱实时辰，基因组数据越来越多地被用于连络系统发育关系，使得领有圆善的核和细胞器基因组序列的物种数量赶快增多[4]。使用高通量测序技能不错更高效地得志对动植物线粒体或叶绿体的测序等连络限制的连络需求[5-9]。跟着测序技能的发展，多数植物的叶绿体基因组取得公布，通过对以高通量测序为基础取得的叶绿体基因组序列为连络材料进行组装选藏[10-15]，为不同植物物种强项[16]、谱系地舆学[17]、进化能源学[18]等方面的连络提供了数据撑捏[19]。

长爪栘[木衣] (Docynia longiunguis Q. Luo & J. L. Liu) 为蔷薇科(Rosaceae) 栘[木衣]属(Docynia) 植物，于2009年3月被初度发现，经不雅察发现与同属的栘[木衣] [Docynia indica (Wall.) Dcne.]和云南栘[木衣] [Docynia delavayi (Franch.) Schneid.]在花的大小和花瓣基部等特征方面有显赫区别[20]。栘[木衣]属植物是额外具有诓骗价值的野生资源，用途十分肤浅[21]。除了其果实不错食用外，其树叶的内含物是很好的抗氧化剂，索取物有降血糖血脂的作用；其根、树皮、果还可用于入药，可调养烫伤、骨折等[22-24]。此外，栘[木衣]植物的果实与苹果(Malus pumila) 等生果比较，其常量及微量元素含量更为丰富[25]。现在对栘[木衣]属其他两个种的连络主要集中在次生代谢物功能分析[24]、灵验因素索取[26]以及生物学秉性和物候特征[27]等方面。

本连络诓骗高通量测序技能对长爪栘[木衣]叶绿体基因组进行测序，并以已发表的云南栘[木衣]等近缘种的叶绿体基因组序列为参考，拼接取得长爪栘[木衣]叶绿体基因组全序列，以此进行系统发育、序列对比、密码子偏好性瓜分析；并揭示长爪栘[木衣]与其他蔷薇科植物的进化关系过头在系统发育中的地位，对了解栘[木衣]属主要谱系之间的系统发育关系有一定的风趣，为长爪栘[木衣]资源强项、开采和诓骗提供表面依据。

1 材料与身手 1.1 实验材料

所用长爪栘[木衣]样底本源于四川省凉山州西昌市(102°15′ E， 27°51′ N)，海拔为1 712 m。采摘崭新幼嫩的叶片，液氮中速冻后存于–80 ℃雪柜保存备用。

1.2 身手 1.2.1 基因组DNA索取及测序

以长爪栘[木衣]的幼嫩叶片为材料，参照张鲁杰的调动CTAB法[28]，索取长爪栘[木衣]基因组DNA。使用分光光度计检测所提样品的DNA浓度，并用1%的琼脂糖凝胶电泳检测索取的DNA纯度。送至安诺优达基因科技(北京) 有限公司使用Illumina测序平台进行高通量测序。

1.2.2 序列拼接及选藏

长爪栘[木衣]叶绿体基因组的序列拼接通过MEGA 5.1软件进行，以NCBI上已公布的云南栘[木衣] (D. delavayi) 叶绿体基因组序列为参考序列(KX499860) 进行组装。并将组装好的序列用Genious 8.1.3软件进行选藏，装配该软件中的MAFFT插件，将该序列与其他近缘种序列进行比对选藏[29]。对总共的卵白编码基因组的相关实践进行检查，并将其修正至准确位置，进而取得圆善的选藏效果[30]。诓骗在线软件OGDRAW[31]绘图长爪栘[木衣]叶绿体基因组物理图谱。选藏完成后，提交至NCBI数据库，登录号为MW367027。

巨臀 波多黎各 女神 1.2.3 叶绿体基因组基因特征分析

叶绿体基因组完成拼接和选藏后，在Geneious软件中完成其特征分析[32]，包括基因组全长、各个区域长度及GC含量、基因数量和类型、基因拷贝情况等。

1.2.4 系统发育分析

从NCBI数据库下载已报谈的蔷薇科12个属24个种的叶绿体基因组并以鼠李科(Rhamnaceae) 枣属的枣(Ziziphus jujuba) 行为外类群，与测序取得的长爪栘[木衣]叶绿体基因组进行聚类分析，并连络其系统发育关系。使用MAFFT对序列进行比对，诓骗IQ-TREE v1.6.1软件并使用最大似然法(maximum likelihood， ML) 进行系统发育树的构建，聘用最好模子TVM+F+R2，进化树用1 000次类似bootstrap西宾，构建系统发育树[33]。并对长爪栘[木衣]的系统进化关系进行分析。具体所选物种见表 1。

1.2.5 叶绿体基因组序列的比对分析

登第枇杷(Eriobotrya japonica， KT633951)、栘[木衣] (D. indica， MN088849)、欧好意思梨(Pyrus communis， MN577870)、湖北海棠(Malus hupehensis， MK020147) 及云南栘[木衣] (D. delavayi， KX499860) 5个物种lisa ai换脸，使用mVISTA软件与长爪栘[木衣]叶绿体基因组序列进行可视化分析，并进一步分析其序列之间的异同。将拼接好的6个样本序列以.fasta的时局上传至在线网站mVISTA，在Shuffle-LAGAN算法花式下进行比对。输出可视性文献并进行比较分析[32]。诓骗DNAsp v.5.0软件打算核苷酸多态性(nucleotide polymorphism， Pi)，将参数成就为Window length大小为600 bp，每个位点之间的距离为200 bp，构建多态性位点折线图[34]。

1.2.6 叶绿体基因组范围区的减弱扩张

将藏南栒子(Cotoneaster taylorii， MN577872)、中华落叶石楠(Pourthiaea arguta， MN061991)、栘[木衣] (D. indica， MN088849)、云南栘[木衣] (D. delavayi， KX499860)、欧好意思梨(Pyrus communis， MN577870)、湖北海棠(Malus hupehensis， MK020147)、榅桲(Cydonia oblonga， KX499857)、甘肃山楂(Crataegus kansuensis， MF784433) 及木瓜(Chaenomeles sinensis， MN577871) 9个物种与长爪栘[木衣]叶绿体基因组进行IR/SC范围分析。将长爪栘[木衣]过头近缘种叶绿体基因组序列保存为.gb时局，上传至在线分析网站IRscope与长爪栘[木衣]比对，进行叶绿体基因组IR区范围图的绘图，将叶绿体基因组范围区域上的基因可视化，并通过比较4个范围区域的基因散播对IR区进行减弱和扩张的分析。

1.2.7 密码子偏好性分析

使用CodonW软件对长爪栘[木衣]叶绿体基因组CDS的密码子数量、密码子使用频率和同义密码子相对使费用进行分析。

2 效果与分析 2.1 叶绿体基因组的基本特征

长爪栘[木衣]叶绿体基因组结构特征与大多数被子植物叶绿体基因组类似，呈典型四段式结构，总长度为158 914 bp，包括反向类似区IRa和IRb各26 369 bp，大的单拷贝(LSC) 区和小的单拷贝(SSC) 区长度别离为87 020 bp和19 156 bp (图 1)。总GC含量为36.7%，AT含量为63.3%。各区段具体的碱基组主见表 2。

通过分析选藏，长爪栘[木衣]叶绿体基因组共有102个功能性基因(剔除类似后)，包括72个卵白编码基因、26个tRNA基因和4个rRNA基因。其中15个基因有两个拷贝，包括7个卵白编码基因(rps7、rps12、rpl2、rpl23、psaI、ndhB、ycf2)，4个tRNA基因(trnL-CAA、trnN-GUU、trnR-ACG、trnV-GAC) 和4个rRNA基因(rrn16、rrn23、rrn4.5、rrn5)。具体见表 3。

2.2 长爪栘[木衣]叶绿体基因组系统发育分析

本连络为了详情长爪栘[木衣]在蔷薇科的系统位置，从NCBI波折载了23个蔷薇科各属物种的叶绿体基因组行为参考进行全局比对，并以鼠李科枣属的枣(Ziziphus jujuba) 为外类群，构建了ML系统发育树(图 2)。

效果标明，聚类的支捏率较高，只好少部分分支的西宾分值未达到100%。总共蔷薇科物种聚为一支，鼠李科枣属的枣成一支。总共蔷薇科物种分为4猛进化支，第1支由牛筋条属的牛筋条、榅桲属的榅桲和石楠属的毛叶石楠及中华落叶石楠聚在沿途，标明蔷薇科中牛筋条属、榅桲属、石楠属的亲缘关系较近；第2支由栒子属的藏南栒子、华中栒子、柳叶栒子、小叶栒子、红花栒子、黄杨叶栒子以及梨属的欧好意思梨聚在沿途，评释栒子属与梨属亲缘关系较近；第3支由栘[木衣]属的长爪栘[木衣]、栘[木衣]及云南栘[木衣]和苹果属的三叶海棠、山荆子、湖北海棠以及木瓜海棠属的木瓜组成；第4分支由枇杷属的枇杷、麻栗坡枇杷、倒卵叶枇杷、怒江枇杷和石斑木属的石斑木以及柳叶石斑木组成。聚类分析效果标明，苹果属与栘[木衣]属亲缘关系最近，其次是枇杷属和木瓜海棠属。

2.3 长爪栘[木衣]叶绿体基因组序列比对分析

为连络长爪栘[木衣]与其他蔷薇科植物在叶绿体基因组序列上的异同，对长爪栘[木衣]过头近缘种进行全序列比对分析(图 3)。效果败露，6个蔷薇科植物叶绿体基因组之间具有高度的雷同性，但同期也存在着一些各别。其中，变异较大的区域为trnY (GUA)-psbD、ndhC-trnV (UAC)、accD-psaI、psbZ-trnfM (CAU)和ndhF-trnL。

六种蔷薇科植物叶绿体基因组序列经过MAFFT比对后通过DNAsp软件分析，效果败露IR区的核酸变异度显赫低于LSC区和SSC区(图 4)。其中，位于LSC区的petA-psbJ基因间区的Pi值为最高达到了0.024 33。图中有3处0.015 < Pi < 0.02的热门，别离是petD-rpoA、rpl33-rpl14基因间区以及ycf1基因区；有7处0.01 < Pi < 0.015的热门，别离是psbZ-rps14、accD-psaI、trnR (ACG)-trnA (UGC)、rps12-rps7基因间区及rpoB、ycf3、rpl22三处基因区，阐扬出了较高水平的核苷酸种种性。以上效果评释在叶绿体基因组中LSC区及SSC区为变异发生的高频区域。

2.4 长爪栘[木衣]叶绿体基因组IR区范围的减弱和扩张分析

基因组IR区范围的减弱和扩张分析效果标明，参与对比的10栽植物IR区长度变化不大(26 249–26 399 bp)。图 5中长爪栘[木衣]、栘[木衣]和榅桲的rps19基因处于LSC，其余近缘种的IRb区扩张到了rps19基因中，且扩张长度均为120 bp。在这10栽植物叶绿体基因组中，王人有ycf1基因的存在，其中一些物种的ycf1基因蔓延至SSC区域几个碱基，其余均位于IRb区中。总共物种在SSC/Ira范围上的基因散播十分雷同，IR区均蔓延至ycf1基因里面，除榅桲Cydonia oblonga的ycf1基因长度较短为2 297 bp外，其他种的ycf1基因长度均大于5 600 bp。总共10栽植物的IRb区均蔓延进位于SSC区域中的ndhF基因中12–14 bp。除长爪栘[木衣]外，其他序列中均有trnH基因位于IRa/LSC区接壤处且王人莫得越过范围。

2.5 密码子偏好性分析

长爪栘[木衣]叶绿体基因密码子偏好性分析发现，其叶绿体基因组中RSCU值> 1的密码子为34个(图 6)，且其中有27个密码子所以A/T收尾，评释长爪栘[木衣]叶绿体基因组的密码子偏向于以A/T收尾，不偏好于以C/G收尾。分析效果标明，异亮氨酸(Ile) 的密码子编码数量最多，达到了1 205个，占比约为8.77%；而半胱氨酸(Cys) 的密码子数量最少为294个，占比为1.93%。编码亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)、苏氨酸(Thr)、赖氨酸(Lys) 和丝氨酸(Ser) 的密码子所占比例别离为8.76%、6.77%、5.82%、5.81%和5.46%。在总共的密码子中，使用次数最多的为赖氨酸的AAA，次数为545，相悖使用次数最少的密码子是精氨酸(Arg) 的CGC，为60次；偏好于以UAA行为圮绝密码子。

3 筹谋

本连络诓骗高通量测序技能对长爪栘[木衣]叶绿体基因组进行了测序，在拼接组装后取得了圆善的叶绿体基因组。在此基础上，进行了系统发育、序列比对、范围扩张减弱、密码子偏好性瓜分析。长爪栘[木衣]叶绿体全基因组长度为158 914 bp，其中LSC长度为87 020 bp，SSC长度为19 156 bp，IRs的长度为26 369 bp，与被子植物叶绿体基因组基本特征相吻合[35]。长爪栘[木衣]叶绿体全基因组的GC含量为36.75%，AT含量为63.25%，AT含量领会高于GC含量，与栘[木衣]属其他两栽植物有微小的差距(栘[木衣] GC含量为36.64%，云南栘[木衣] GC含量为36.66%)[36-37]。因为在基因组中GC含量越高、AT含量越低，DNA密度就越大，序列则较为保守且不易变性[38]。因此证据这一秉性可估计长爪栘[木衣]叶绿体基因组序列具有一定的易变性，可能会导致其基因序列比其他物种的叶绿体基因组序列愈加容易产生变异。

使用最大似然法对近缘种的叶绿体基因组与测序取得的长爪栘[木衣]叶绿体基因组进行聚类分析。由组成的ML系统发育树可得，除榅桲、牛筋条这一分支外各分支支捏率均较高。聚类效果标明，栘[木衣]属与木瓜属及苹果属植物聚为一支，这与前东谈主对蔷薇科植物所作的聚类效果一致[39-40]，评释以该身手取得的聚类分析效果是可靠的。该连络效果为进一步详情蔷薇科各属植物的发祥及亲缘关系提供了一定的依据。

IR区和SC区范围的彭胀和减弱被以为是被子植物叶绿体全基因组大小变化的主要机制[41]，不同物种的叶绿体基因组的IR/SC范围位置变化是不同的，而这些变化在归并科的物种上也会有所不同[41]。对10种蔷薇科叶绿体基因组IR/SC范围区域的分析效果标明，这些叶绿体基因组的IR区域王人存在扩张或减弱的征象。长爪栘[木衣]的rps19基因莫得跨过LSC/IR范围处(距离范围处10 bp)，这标明了长爪栘[木衣]的IR区相关于其他近缘种有较为领会的减弱[42]，这种减弱可能是酿成长爪栘[木衣]叶绿体基因组的长度短于其他近缘种序列的长度的主要原因。这一效果与Cheng等[43]对草莓(Fragaria×ananassa) 过头近缘种叶绿体基因组进行范围分析取得的效果雷同；然则这种情况在对白芥属(Sinapis) 植物[44]及姜科(Zingiberaceae) 植物[45]的连络里并未出现。由此估计酿成这一各别的原因可能是植物进化经由中IR/SC范围不同进度的扩张和减弱导致了范围和基因组长度的种种性[46]。

本连络将长爪栘[木衣]过头5个近缘种叶绿体基因组序列进行比对分析，发现参试的叶绿体基因组序列之间存在着高度的雷同性，存在着几个变异较大的区域。这些处于热门区域的各别位点对DNA条形码的开采有首要的参考价值，从而不错应用于种质资源强项过头他连络[47]。在核酸种种性分析中可知，所发现的变异位点Pi值范围在0.005 6–0.024 33之间，同期筛选出11个变异位点，其中8个位于LSC区，3个位于SSC区，而两个IR区的核酸变异度则较低。荒谬是ycf1基因处的核酸变异度较高，其原因可能是因为该基因卓绝了IR区与SSC区的接壤处，也可能是存在着类似序列[48]。这与对日本落叶松(Larix kaempferi) 及龙血树(Dracaena draco) 等植物的分析中发现的IR区核酸变异度较高的情况有各别[49-50]，评释叶绿体基因组在不同区域和不同物种间有着不同的进化速度[51]，这些高变区域不错行为对栘[木衣]属植物进行进化分析连络的依据[52]。

密码子偏好性肤浅存在于当然界植物基因组中，是在弥远的进化发育中演变而来，会对其酿成影响的因素有好多，包括突变、聘用、基因长度、基因功能等[53]。通过密码子偏好性分析效果发现，RSCU值> 1的密码子为34个，而第3位是A/T的密码子达到了27个，占总量的79.4%，评释长爪栘[木衣]叶绿体基因密码子偏好于以A/T收尾。这一特色与沙枣(Elaeagnus angustifolia)、阔叶猕猴桃(Actinidia latifolia)、羽叶丁香(Syringa pinnatifolia) 等植物叶绿体基因组的特征王人基本一致，评释不同物种之间密码子偏好性有着一定的雷同性，而这一秉性的产生可能与变异、当然聘用过头他方面相相关[54-56]。

4 论断

本连络初度使用高通量测序技能对长爪栘[木衣]样本进行测序，并进行序列的组装拼接，取得圆善的长爪栘[木衣]叶绿体基因组序列。连络发现长爪栘[木衣]叶绿体基因组长度为158 914 bp，呈典型的环状四分体结构；去除类似后该叶绿体基因组共有104个功能性基因。长爪栘[木衣]叶绿体基因组更偏向于使用含有A/T的密码子。对长爪栘[木衣]叶绿体基因组进行组装选藏、系统发育分析及序列比对瓜分析，对了解栘[木衣]属各个种之间的系统发育关系有首要风趣，故意于对栘[木衣]属植物质源的开采诓骗lisa ai换脸，为该物种的下一步连络提供了表面依据。